Tre grammi di acido D-aspartico aumentano i livelli di testosterone di un terzo

[greatescape]

Il ruolo e il meccanismo molecolare di acido D-aspartico nel rilascio e la sintesi di LH e di testosterone nell'uomo e nel ratto

Enza Topo 1 Enza Topo 1 email , Andrea Soricelli 2 , Andrea Soricelli 2 email , Antimo D'Aniello 1 , Antimo D'Aniello 1 email , Salvatore Ronsini 3 , Salvatore Ronsini 3 email and Gemma D'Aniello 3 e Gemma D'Aniello 3 email

1 Stazione Zoologica Anton Dohrn, 80121, Villa Comunale, 80121, Napoli, Italy 1 Stazione Zoologica Anton Dohrn, 80121, Villa Comunale, 80121, Napoli, Italia

2 Università di Napoli Parthenope e Fondazione IRCCS-SDN, Via Gianturco 113, 80143 Naples, Italy 2 Università di Napoli Parthenope e Fondazione IRCCS-SDN, Via Gianturco 113, 80143 Napoli, Italia

3 Department of Obstetrics and Gynecology, and Reproductive Medicine (IVF Unit), Hospital 'S Luca', 84078 Vallo della Lucania, Italy 3 Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia e Medicina della Riproduzione (IVF Unit), Ospedale 'S Luca', 84078 Vallo della Lucania, Italia

author email Autore e-mail corresponding author email email autore corrispondente

Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7 : 120 doi:10.1186/1477-7827-7-120 Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7: 120 DOI: 10.1186/1477-7827-7-120

The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: Reproductive Biology and Endocrinology | Full text | The role and molecular mechanism of D-aspartic acid in the release and synthesis of LH and testosterone in human and rats La versione elettronica di questo articolo è quella completa e può essere consultato on-line su: Reproductive Biology and Endocrinology | Full text | The role and molecular mechanism of D-aspartic acid in the release and synthesis of LH and testosterone in human and rats
Received: Received: 29 August 2009 29 agosto 2009
Accepted: Accettiamo: 27 October 2009 27 ottobre 2009
Published: Pubblicato il: 27 October 2009 27 ottobre 2009

© 2009 Topo et al; licensee BioMed Central Ltd. © 2009 Topo et al; licenziatario BioMed Central Ltd.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License ( Creative Commons — Attribution 2.0 Generic ), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Questo è un articolo Open Access distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License (Creative Commons — Attribution 2.0 Generic), che consente un utilizzo senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, purché l'opera originale è correttamente citati.
Abstract Abstract
Background Sfondo

D-aspartic acid is an amino acid present in neuroendocrine tissues of invertebrates and vertebrates, including rats and humans. D-acido aspartico è un aminoacido presente nei tessuti neuroendocrini di invertebrati e vertebrati, compresi ratti e gli esseri umani. Here we investigated the effect of this amino acid on the release of LH and testosterone in the serum of humans and rats. Qui abbiamo studiato l'effetto di questo aminoacido sul rilascio di LH e testosterone nel siero di esseri umani e ratti. Furthermore, we investigated the role of D-aspartate in the synthesis of LH and testosterone in the pituitary and testes of rats, and the molecular mechanisms by which this amino acid triggers its action. Inoltre, abbiamo studiato il ruolo del D-aspartato nella sintesi di LH e testosterone nella ghiandola pituitaria e testicoli di ratti, ed i meccanismi molecolari con cui questo aminoacido innesca la sua azione.
Methods Metodi

For humans: A group of 23 men were given a daily dose of D-aspartate (DADAVIT ® ) for 12 days, whereas another group of 20 men were given a placebo. Per gli esseri umani: un gruppo di 23 uomini è stata data una dose giornaliera di D-aspartato (DADAVIT ®) per 12 giorni, mentre un altro gruppo di 20 uomini hanno ricevuto un placebo. For rats: A group of 10 rats drank a solution of either 20 mM D-aspartate or a placebo for 12 days. Per i ratti: un gruppo di 10 ratti bevuto una soluzione di una 20 mm D-aspartato o un placebo per 12 giorni. Then LH and testosterone accumulation was determined in the serum and D-aspartate accumulation in tissues. Poi LH e l'accumulo di testosterone è stato determinato nel siero e il D-aspartato accumulo nei tessuti. The effects of D-aspartate on the synthesis of LH and testosterone were gauged on isolated rat pituitary and Leydig cells. Gli effetti del D-aspartato sulla sintesi di LH e testosterone sono state calibrate sul ipofisi di ratto isolati e cellule di Leydig. Tissues were incubated with D-aspartate, and then the concentration (synthesis) of LH and cGMP in the pituitary and of testosterone and cAMP in the Leydig cells was determined. I tessuti sono stati incubati con D-aspartato, e quindi la concentrazione (sintesi) di LH e di cGMP nel dell'ipofisi e del testosterone e di cAMP nelle cellule di Leydig è stato determinato.
Results Risultati

In humans and rats, sodium D-aspartate induces an enhancement of LH and testosterone release. Negli esseri umani e ratti, sodio D-aspartato induce un miglioramento di LH e il rilascio di testosterone. In the rat pituitary, sodium D-aspartate increases the release and synthesis of LH through the involvement of cGMP as a second messenger, whereas in rat testis Leydig cells, it increases the synthesis and release of testosterone and cAMP is implicated as second messenger. Nella ghiandola pituitaria ratto, sodio D-aspartato aumenta il rilascio e la sintesi di LH, attraverso il coinvolgimento di cGMP come un secondo messaggero, mentre in cellule di Leydig del testicolo di ratto, aumenta la sintesi e il rilascio di testosterone e di cAMP è implicato come secondo messaggero. In the pituitary and in testes D-Asp is synthesized by a D-aspartate racemase which convert L-Asp into D-Asp. Nella ghiandola pituitaria e nei testicoli D-Asp è sintetizzato da un D-aspartato racemasi che convertono L-Asp in D-Asp. The pituitary and testes possesses a high capacity to trapping circulating D-Asp from hexogen or endogen sources. L'ipofisi e testicoli possiede una elevata capacità di cattura che circolano D-Asp da fonti esogene o Endogen.
Conclusion Conclusione

D-aspartic acid is a physiological amino acid occurring principally in the pituitary gland and testes and has a role in the regulation of the release and synthesis of LH and testosterone in humans and rats. D-acido aspartico è un amino acido fisiologico che si verificano principalmente nella ghiandola pituitaria e testicoli e ha un ruolo nella regolazione del rilascio e la sintesi di LH e di testosterone nell'uomo e nel ratto.
Background Sfondo

D-Aspartic acid (D-Asp) is an endogenous amino acid which has been found in the neuroendocrine tissues of both invertebrates and vertebrates Acido D-aspartico (D-Asp) è un acido endogena amminoacidi che è stata trovata nei tessuti neuroendocrini di entrambi i vertebrati e invertebrati [ 1 ]. [1]. D-Asp was first found in the nervous system of marine mollusks D-ASP è stato trovato per primo nel sistema nervoso dei molluschi marini [ 2 ] and subsequently in the nervous and endocrine tissues of many other animals, including humans [2] e successivamente nei tessuti nervoso ed endocrino di molti altri animali, compresi gli esseri umani [ 1 ]. [1]. High levels of D-Asp occur transiently in the brain of chickens, rats and humans during the last stage of embryonic life, suggesting that it has a role in the development of the nervous system Gli alti livelli di D-Asp transitoriamente si verificano nel cervello dei polli, topi ed esseri umani durante l'ultima fase della vita embrionale, suggerendo che essa ha un ruolo nello sviluppo del sistema nervoso [ 3 - 6 ]. [3 - 6]. In addition, within the nervous system this amino acid is concentrated in the axon terminals (synaptosomes) and in synaptic vesicles together with L-Asp and L-Glu Inoltre, all'interno del sistema nervoso questo aminoacido è concentrata nei terminali assoni (sinaptosomi) e in vescicole sinaptiche con L-Asp e L-Glu [ 7 ]; additionally, it is involved in visual activity [7], in più, si è coinvolto in attività di Visual [ 8 ], suggesting it has a role in neurotransmission. [8], suggerendo che ha un ruolo nella neurotrasmissione.

In the endocrine system, high concentrations of D-Asp have been recorded in rat testes at birth as well as following sexual maturity Nel sistema endocrino, alte concentrazioni di D-Asp sono stati registrati nei testicoli di ratto alla nascita così come segue la maturità sessuale [ 5 ]. [5]. Further research involving rats showed the highest concentrations of D-Asp in testicular venous blood plasma, as well as in the rete testis, the epididimus, testicular parenchymal cells, seminiferous tubules, interstitial fluid and spermatozoa Ulteriori ricerche che coinvolgono ratti hanno mostrato la più alta concentrazione di D-Asp in testicolare plasma del sangue venoso, così come nella rete testis, il epididimus, cellule del parenchima del testicolo, tubuli seminiferi, liquido interstiziale e spermatozoi [ 9 ], suggesting that D-Asp is involved in spermatogenesis. [9], suggerendo che il D-Asp è coinvolto nella spermatogenesi. A specific D-Asp localization was further observed in rat testes either in elongate spermatidits Uno specifico D-Asp localizzazione è stata ulteriormente osservato nel ratto testicoli sia in allungare spermatidits [ 10 ] or in Leydig cells [10] o in cellule di Leydig [ 11 ]. [11]. Several further studies have demonstrated that D-Asp is concentrated in the endocrine gland, particularly in the pineal gland, the pituitary and the testis Diversi studi hanno dimostrato che il D-Asp si concentra nella ghiandola endocrina, in particolare nella ghiandola pineale, la pituitaria e del testicolo [ 1 , 12 ]. [1, 12]. It has been observed that D-Asp in rats is capable of eliciting the release of the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) from the hypothalamus, the luteinizing hormone (LH) and the growth hormone (GH) from the pituitary gland, and testosterone from the testes È stato osservato che il D-Asp nei ratti è in grado di suscitare la liberazione del GnRH (GnRH), da l'ipotalamo, l'ormone luteinizzante (LH) e dell'ormone della crescita (GH) dalla ghiandola pituitaria, e testosterone da i testicoli [ 13 ]. [13]. In addition, D-Asp occurs in a high concentration in the pineal gland Inoltre, D-Asp si verifica in una concentrazione elevata nella ghiandola pineale [ 14 ], where it modulates melatonin synthesis in rat pinealocytes [14], dove modula la sintesi di melatonina nel ratto pinealocytes [ 15 ], and is implicated in the α -melanocyte-stimulating hormone, GABA, and in dopamine release [15], ed è implicato nella α-ormone-melanociti stimolante, GABA, e il rilascio di dopamina [ 16 ]. [16]. In sheep, D-Asp is endogenously present in tissues and is electively stored in endocrine glands, such as the pituitary, and in the brain after its administration. Negli ovini, D-Asp è endogeno presente nei tessuti ed è elettivamente memorizzati in ghiandole endocrine, come ad esempio l'ipofisi, e nel cervello, dopo la sua somministrazione. NMDA and LH increased following D-Asp administration NMDA e LH aumentato dopo somministrazione di D-Asp [ 17 ]. [17]. Recently an in vitro study carried out on boar testes revealed that endogenous testicular D-Asp enhances gonad aromatase activity Recentemente uno studio in vitro effettuati su testicoli cinghiale ha rivelato che endogena testicolare D-Asp potenzia gonade attività dell'aromatasi [ 18 ], the key enzyme that converts testosterone into 17 β -estradiol. [18], l'enzima chiave che converte il testosterone in 17 β-estradiolo. In addition, studies done on the testes and ovary of the lizard Podarcis s. Inoltre, studi condotti sui testicoli e ovaie della lucertola Podarcis s. sicula have shown similar findings, confirming that D-Asp is involved in the local production of estrogen sicula hanno mostrato risultati simili, a conferma che il D-Asp è coinvolta nella produzione locale di estrogeni [ 19 , 20 ]. [19, 20].

On the basis of the above findings, D-Asp seems to play a crucial role in reproduction either due to its suggested role of neuromodulator or because it is involved in biosynthesis and the release of sexual hormones. Sulla base delle risultanze di cui sopra, D-Asp sembra giocare un ruolo cruciale nella riproduzione sia per il suo ruolo ha suggerito di neuromodulator o perché è coinvolto nella biosintesi e il rilascio di ormoni sessuali. Recent studies analyzed the role of D-Asp in human reproduction in both females and males. Recenti studi hanno analizzato il ruolo del D-Asp nella riproduzione umana, sia maschi e femmine. In men, a lower D-Asp content was found in oligoasthenoteratospermic seminal fluid and spermatozoon, and a relationship exists between the amount and motility of semen and the content of D-Asp Negli uomini, un basso contenuto di D-Asp è stato trovato in oligoasthenoteratospermic liquido seminale e spermatozoi, e un rapporto esiste tra la quantità e la motilità dello sperma e il contenuto di D-Asp [ 21 ]. [21]. In women, it has been found that D-Asp occurs in the follicular fluid as a physiological component, and interestingly, the concentration of D-Asp in the fluid is reduced in older women. Nelle donne, si è scoperto che il D-Asp si verifica nel liquido follicolare come una componente fisiologica, ed è interessante notare la concentrazione di D-Asp nel fluido è ridotta nelle donne anziane. In addition, the concentration of D-Asp in the follicular fluid is lower, as are the quality of the oocytes and the level of fertilization Inoltre, la concentrazione di D-Asp nel liquido follicolare è inferiore, come lo sono la qualità degli ovociti e il livello di fecondazione [ 22 ]. [22].

Although numerous studies have been conducted on this matter, no investigations have been done until now on the effects of D-Asp on the secretion of LH and testosterone in humans, and neither has the molecular mechanism by which D-Asp triggers it action in the synthesis and release of these hormones been investigated. Sebbene numerosi studi sono stati condotti su questo tema, le indagini non sono state fatte fino ad ora sugli effetti del D-Asp sulla secrezione di LH e testosterone negli esseri umani, e non ha il meccanismo molecolare con cui D-Asp trigger sulle azioni in la sintesi e il rilascio di questi ormoni sono stati indagati. This study aims to evaluate the effects of D-aspartate administration on LH and testosterone production in humans and rats and to understand the biochemical mechanisms by which D-Asp induces the synthesis and release of LH and testosterone, using rats as the model animal. Questo studio mira a valutare gli effetti della somministrazione di D-aspartato On LH e la produzione di testosterone nell'uomo e nel ratto e di comprendere i meccanismi biochimici con cui D-Asp induce la sintesi e il rilascio di LH e testosterone, utilizzando topi come modello animale.
Methods Metodi
Determination of D-Asp by HPLC associate with D-AspO Determinazione del D-Asp da associare HPLC con D-Aspo

The determination of D-Asp in serum and tissues was carried out using an HPLC enzymatic method combined with D-aspartate oxidase (D-AspO) according to our previously described method La determinazione del D-Asp nel siero e nei tessuti è stata effettuata utilizzando un metodo HPLC enzimatica in combinazione con D-aspartato ossidasi (D-Aspo), secondo il nostro metodo precedentemente descritto [ 8 ]. [8]. For the serum, 0.4 ml serum was mixed with 3.6 ml of 0.2 M TCA and centrifuged at 10,000 g for 10 min. Per il siero, 0.4 ml di siero è stato mescolato con 3,6 ml di 0,2 M TCA e centrifugato a 10.000 g per 10 min. The supernatant was purified on cation exchange resin (AG 50WX8). Il surnatante è stato purificato su resina a scambio cationico (AG 50WX8). The purified sample was dissolved in 0.4 ml H 2 O and then 50 μ l were used for HPLC according to the described method Il campione purificato è stato sciolto in 0,4 ml di H 2 O e quindi l 50 μ sono stati utilizzati per HPLC secondo il metodo descritto [ 8 ]. [8]. For solid tissues 10-100 mg tissues were homogenized at a ratio of 1:50 with 0.1 M TCA and centrifuged as above. Per i tessuti solidi 10-100 mg di tessuto sono stati omogeneizzati con un rapporto di 1:50 con 0.1 M TCA e centrifugato come sopra. The supernatant was purified as above and analyzed at HPLC as described Il surnatante è stato purificato come sopra e analizzati in HPLC come descritto [ 8 ]. [8]. In order to quantify the content in amino acids in the sample, a standard curve consisting of 50 pmoles of D-Asp and 100 pmoles of each of the following amino acids: L-Asp, L-Glu, L-Ser, L-Thr, L-His, Gly, L-Arg, L-Ala, L-Val, L-Met, L-Tyr, L-Phe, L-Ile, L-Leu and L-Lys was carried out in the same assay condition. Al fine di quantificare il contenuto in aminoacidi del campione, costituito da una curva standard di 50 pmoli di D-Asp e 100 pmoli di ciascuno dei seguenti amminoacidi: L-Asp, L-Glu, Ser-L, L-Thr , L-His, Gly, L-Arg, L-Ala, L-Val, Met-L, L-Tyr, Phe-L, L-Ile, L-Leu e L-Lys è stata effettuata alle stesse condizioni di test . The method allowed the determination with high reliability of a minimum amount of D-Asp at a coefficient of variation (CV) of 5% as calculated from 10 repeated analyses of D-Asp from a sample in which a known amount of D-Asp has been added. Il metodo ha permesso la determinazione con l'alta affidabilità di un importo minimo di D-Asp ad un coefficiente di variazione (CV) del 5%, calcolata dal 10 analisi ripetute del D-Asp da un campione in cui una quantità nota di D-Asp ha stati aggiunti.
Effects of D-aspartate on LH and testosterone in serum release in humans and rats Gli effetti del D-aspartato On LH e testosterone nel siero di rilascio negli esseri umani e ratti

The experiment using human subjects was carried out on two groups of healthy male volunteers aged between 27 and 37 years at the IVF (in vitro fertilization) Unit, Hospital "S. Luca", Vallo della Lucania, Italy. L'esperimento con soggetti umani è stata condotta su due gruppi di volontari maschi sani di età compresa tra i 27 ei 37 anni al IVF (fertilizzazione in vitro) Unit, Ospedale "S. Luca", Vallo della Lucania, Italia. The first group was composed of 23 volunteers who constituted the experimental group; the second group was composed of 20 volunteer who constituted the placebo group. Il primo gruppo era composto da 23 volontari che hanno costituito il gruppo sperimentale, il secondo gruppo era composto da 20 volontari che hanno costituito il gruppo placebo. Informed consent was obtained from each participant and the procedure was approved by the Institutional Review Board of the Hospital. Il consenso informato è stato ottenuto da ciascun partecipante e la procedura è stata approvata dalla Institutional Review Board del Policlinico. Every morning at breakfast for 12 consecutive days subjects in the first group were invited to consume, by mouth a solution of 10 ml of 2.0 M sodium D-aspartate (3.12 g/10 ml) supplemented with vitamin B6, folic acid and vitamin B12 and diluted in half a glass of water or fruit juice. Ogni mattina a colazione per 12 giorni consecutivi soggetti del primo gruppo sono stati invitati a consumare, per bocca di una soluzione di 10 ml di 2,0 M di sodio D-aspartato (3,12 g/10 ml) integrato con vitamina B6, acido folico e vitamina B12 e diluito in mezzo bicchiere d'acqua o succo di frutta. This solution is marketed in Italy under the name DADAVIT ® (Pharmaguida srl, Italy) and used as a supplement to increase the quality of human seminal fluid. Questa soluzione è commercializzato in Italia sotto il nome DADAVIT ® (srl Pharmaguida, Italia) e utilizzato come integratore per aumentare la qualità del liquido seminale umano. The participants belonging to the placebo group received 10 ml of a solution consisting of 2 M NaCl (1.12 g/10 ml in water) containing the same vitamins as above, and this solution was packaged as DADAVIT ® solution (termed DADAVIT ® placebo). I partecipanti appartenenti al gruppo placebo hanno ricevuto 10 ml di una soluzione composta da 2 M NaCl (1,12 g/10 ml di acqua) che contengono le vitamine come sopra, e questa soluzione è stato confezionato come soluzione DADAVIT ® (denominato DADAVIT ® placebo). Blood samples (8-10 ml) from each participant were taken before treatment, after 6 days of treatment, after 12 days of treatment, and 3 days after suspension of the treatment. I campioni di sangue (8-10 ml) per ciascun partecipante sono state prese prima del trattamento, dopo 6 giorni di trattamento, dopo 12 giorni di trattamento, e 3 giorni dopo la sospensione del trattamento. The blood was taken in the morning between 9.30 and 10.30 am, a time when serum oscillations of LH and testosterone are at their minimum value Il sangue è stata presa la mattina dalle 9.30 alle 10.30, un momento in cui le oscillazioni del siero di LH e testosterone sono al loro valore minimo [ 23 ]. [23]. The determination of LH and testosterone in human blood was carried out using commercially available immunochemoluminescence kits for LH and testosterone purchased from Bayer HealthCare LLC, Subsidiary System (Bayer Corporation, USA). La determinazione di LH e di testosterone nel sangue umano è stata effettuata utilizzando i kit immunochemoluminescence disponibili in commercio per l'LH e testosterone acquistato da Bayer HealthCare LLC, Filiale di sistema (Bayer Corporation, USA). According to the manufacturing company that have prepared the kits for LH and testosterone, the sensitivity of the method was 0.1 mIU/ml for LH and 0.2 ng/ml for testosterone. Secondo la società di produzione che hanno preparato il kit per l'LH e testosterone, la sensibilità del metodo è stata dello 0,1 mUI / ml per l'LH e 0,2 ng / ml per il testosterone.

The experiments on rats were carried out as follows: Adult Wistar male rats (120 days old, 340 ± 20 g), purchased from Charles River laboratory (Italy), were housed 2 per cage in a controlled environmental animal facility with a 12-h light/dark cycle and fed with laboratory food pellets and water ad libitum until experimentation. Gli esperimenti sui ratti sono stati effettuati come segue: ratti adulti Wistar maschi (120 giorni, 340 ± 20 g), ha acquistato da Charles River di laboratorio (Italia), sono stati alloggiati 2 per gabbia in una struttura di controllo ambientale, animale con un 12-h luce / buio e ciclo alimentati con pellet di laboratorio e cibo ad libitum acqua fino a sperimentazione. All the procedures involving rats were in accordance with institutional guidelines. Tutte le procedure che coinvolgono i ratti erano in conformità con gli orientamenti istituzionali. When ready, three groups of 10 animals each were prepared. Quando si è pronti, tre gruppi di 10 animali ciascuno sono stati preparati. Rats in the first group were allowed to drink a solution consisting of 20 mM of sodium D-aspartate for 12 days and then sacrificed. Topi del primo gruppo sono stati autorizzati a bere una soluzione che consiste di 20 mm di sodio D-aspartato per 12 giorni e poi sacrificato. Rats in the second group were given to drink a solution of 20 mM sodium D-aspartate to drink for 12 consecutive days; then allowed to drink tap water for 3 days and then sacrificed. Ratti del secondo gruppo è stata data a bere una soluzione di 20 mm di sodio D-aspartato a bere per 12 giorni consecutivi, poi consentito di bere acqua di rubinetto per 3 giorni e poi sacrificato. Rats in of the third group (control) were given to drink a solution of 20 mM NaCl to drink for 12 days and then sacrificed. In ratti del terzo gruppo (controllo) è stata data a bere una soluzione di 20 mM NaCl a bere per 12 giorni e poi sacrificato. After rats were sacrificed, the blood and solid tissues (frontal cortex, hippocampus, pituitary, testis, liver and kidney) were collected. Dopo i ratti sono stati sacrificati, il sangue e nei tessuti solidi (corteccia frontale, ippocampo, ipofisi, testicoli, fegato e rene) sono stati raccolti. The serum was obtained from the blood (after coagulation and centrifugation at 3,000 g for 30 min) and the concentration of LH and testosterone (hormone release) determined. Il siero è stato ottenuto dal sangue (dopo la coagulazione e centrifugazione a 3000 g per 30 min) e la concentrazione di LH e di testosterone (ormone di rilascio) determinato. The solid tissues were homogenized in PBS at a ratio of 1:20 and centrifuged at 10,000 g for 30 min. I tessuti solidi sono stati omogeneizzati in PBS con un rapporto di 1:20 e centrifugato a 10.000 g per 30 min. The supernatant was used for the analysis of D-Asp by HPLC. Il surnatante è stato utilizzato per l'analisi del D-Asp mediante HPLC.

The determination of LH in the rat serum was carried out using a reagent kit from Amersham Biosciences (EIA Biotrak™ System RPN 2562; Amersham Biosciences Europe GmbH, Cologno Monzese, Milano, Italy), whereas the concentration of testosterone in the rat serum was determined using the same kits and the same procedure that were used for the human serum. La determinazione di LH nel siero di ratto è stata effettuata utilizzando un kit di reagenti da Amersham Biosciences (VIA Biotrak ™ System RPN 2562; Amersham Biosciences Europe GmbH, Cologno Monzese, Milano, Italia), mentre la concentrazione di testosterone nel siero di ratto è stato determinato utilizzando il kit stesso e la stessa procedura che sono stati utilizzati per il siero umano.
Effects of D-aspartate on the rat pituitary in the synthesis of LH and cGMP: In vitro experiments Gli effetti del D-aspartato sulla pituitaria ratto nella sintesi di LH e cGMP: Gli esperimenti in vitro

The pituitary was taken from an adult male rat (120 days old) and cut longitudinally into two portions, and then incubated with moderate shaking at 37°C for 60 min in 1.0 ml of Krebs-Ringer solution, pH 7.4, containing 50 μ l of a cocktail of protease inhibitors (Sigma, P 8340) and also contained 1 mg/ml BSA in air/CO 2 (19:1) and D-Asp at the concentration of 0.1 mM (10 μ l of 10 mM). L'ipofisi è stata presa da un adulto ratti maschi (120 giorni) e tagliate longitudinalmente in due parti, e quindi incubati con agitazione a 37 ° C per 60 minuti in 1,0 ml di soluzione di Krebs-Ringer moderata, pH 7,4, contenente 50 l μ di un cocktail di inibitori della proteasi (Sigma, P 8340) e contiene anche 1 mg / ml BSA in aria / CO 2 (19,1) e D-Asp alla concentrazione di 0,1 mm (10 μ l di 10 mm). The same experiment was repeated using a second male rat, but D-Asp was at the concentration of 1.0 mM (10 μ l of 100 mM). Lo stesso esperimento è stato ripetuto con un topo secondo maschio, ma il D-Asp era la concentrazione di 1,0 mm (10 μ l di 100 mm). The same experiment was repeated on a third male rat, but without D-Asp (control). Lo stesso esperimento è stato ripetuto su un topo terzo maschio, ma senza il D-Asp (controllo). After incubation, each sample was homogenized in its incubation solution and divided into two equal portions. Dopo l'incubazione, ogni campione è stato omogeneizzato nella sua soluzione di incubazione e diviso in due parti uguali. The first portion was centrifuged at 10,000 rpm for 5 min at 4°C, and the supernatant was used for LH determination (synthesis). La prima parte è stato centrifugato a 10.000 rpm per 5 minuti a 4 ° C, e il surnatante è stato utilizzato per la determinazione LH (sintesi). The second portion was mixed with 25 μ l of 1 M HCl and 25 μ l of 1 M TCA, then homogenized and centrifuged. La seconda parte è stato mescolato con 25 μ l di 1 M HCl e 25 μ l di 1 M TCA, poi omogeneizzato e centrifugato. The supernatant was neutralized with 1 M NaOH and used for the determination of cGMP (cyclic guanosine monophosphate; 3',5'-cyclic guanosine monophosphate) and cAMP (cyclic adenosine monophosphate; 3',5'-cyclic adenosine monophosphate). Il surnatante è stata neutralizzata con 1 M NaOH e utilizzati per la determinazione di cGMP (guanosina monofosfato ciclica; 3 ', 5'-monofosfato ciclico della guanosina) e cAMP (adenosina monofosfato ciclico; 3', 5'-monofosfato ciclico). These determinations were carried out using a radioimmunoassay based on the competition between unlabelled cAMP or cGMP and a fixed quantity of the tritium labeled compound (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England (cAMP: code TRK432; cGMP: code TRK500). This experiment was repeated five times on sample from different animals. Tali determinazioni sono state effettuate utilizzando un metodo radioimmunologico basato sulla competizione tra il campo non etichettati o cGMP e una quantità fissa del trizio etichetta (composti Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inghilterra (cAMP: TRK432 codice; cGMP: codice TRK500). Questo esperimento è stato ripetuto per cinque volte su campioni di animali diversi.
Effects of D-aspartate on rat Leydig cells in the synthesis of testosterone and cAMP: In vitro experiments Gli effetti del D-aspartato il ratto delle cellule di Leydig nella sintesi di testosterone e di cAMP: Gli esperimenti in vitro

Leydig cells were prepared from the testes of 5 rats according to the described procedure Le cellule di Leydig sono stati preparati dai testicoli di ratti 5 secondo la procedura descritta [ 24 ]. [24]. The purified Leydig cells were suspended at a concentration of 1 × 10 6 cells/ml in Krebs-Ringer solution containing a cocktail of protease inhibitors (Sigma, P 8340, diluted 1:100) and BSA 1 mg/ml. Il purificato cellule di Leydig sono stati sospesi a una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml in soluzione di Krebs-Ringer contenente un cocktail di inibitori della proteasi (Sigma, P 8340, diluite in 1:100) e BSA 1 mg / ml. To 1 ml of this suspension were added, respectively, 10 μ l of 10 mM of sodium D-aspartate and 10 μ l of 100 mM of sodium D-aspartate (0.1 and 1.0 mM, respectively). A 1 ml di questa sospensione sono stati aggiunti, rispettivamente, 10 μ l di 10 mm di sodio D-aspartato e 10 μ l di 100 mm di sodio D-aspartato (0.1 e 1.0 mm rispettivamente). For the control, 10 μ l of H 2 O was used instead of D-Asp. Per il controllo, 10 μ l di H 2 O è stato usato al posto di D-Asp. The samples were incubated for 60 min at 37°C with moderate shaking. I campioni sono stati incubati per 60 min a 37 ° C con moderata agitazione. Then each sample was homogenized in its solution and divided into two equal portions. Poi ogni campione è stato omogeneizzato nella sua soluzione e diviso in due parti uguali. The first portion was centrifuged at 10,000 g for 5 min, and the supernatant was used for the testosterone determination. La prima parte è stato centrifugato a 10.000 g per 5 minuti, e il surnatante è stato utilizzato per la determinazione di testosterone. The second portion was mixed with 50 μ l of 1 M HCl and 50 μ l of 1 M TCA, then homogenized and centrifuged, and the supernatant was used for the determination of cAMP and cGMP. La seconda parte è stato mescolato con 50 μ l di 1 M HCl e 50 μ l di 1 M TCA, poi omogeneizzato e centrifugato e il surnatante è stato utilizzato per la determinazione di cAMP e cGMP. This experiment was repeated five independent times. Questo esperimento è stato ripetuto per cinque volte indipendenti.
Biosynthesis of D-aspartate in rat tissues: D-aspartate racemase activity Biosintesi di D-aspartato nei tessuti di ratto: D-aspartato attività racemasi

The endogenous presence of D-Asp in rat tissues and in particular in the pituitary gland and testis has suggested that this amino acid is synthesized in vivo by an aspartate racemase (EC 5.1.1.13) which converts L-Asp to D-Asp. La presenza endogena di D-Asp nei tessuti di ratto e in particolare l'ipofisi e testicolo ha suggerito che questo aminoacido viene sintetizzato in vivo da un racemasi aspartato (EC 5.1.1.13), che converte L-Asp di D-Asp. This enzyme has been found in bacteria Questo enzima è stato trovato nei batteri [ 25 ] in mollusks [25] in molluschi [ 7 , 8 , 26 ], in amphibians [7, 8, 26], in anfibi [ 19 ], and in rat neurons [19], e in neuroni di ratto [ 6 ]. [6]. In this study we determined the activity of this enzyme that we have termed 'D-Aspartate racemase because it converts L-Asp into D-Asp, using a modified procedure of the described method In questo studio abbiamo determinato l'attività di questo enzima, che abbiamo chiamato 'D-Aspartato racemasi perché converte L-Asp in D-Asp, utilizzando una procedura di modifica del metodo descritto [ 7 ]. [7]. The procedure consists of two steps: i) incubation of the sample with L-Asp to generate D-Asp; and ii) determination of D-Asp by D-AspO with a colorimetric method. La procedura si compone di due fasi: i) l'incubazione del campione con L-Asp per generare D-Asp, e ii) la determinazione del D-Asp di D-Aspo con un metodo colorimetrico. The reactions involved in the entire procedure are: Le reazioni coinvolte in tutta la procedura sono:

Step 1: Rat tissues were homogenized at a ratio of 1:10 in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, containing 10 mM EDTA, and centrifuged at 20,000 g for 20 min. Fase 1: tessuti di ratto sono stati omogeneizzati con un rapporto di 1:10 in 0.1 M Tris-HCl, pH 8,0, contenente 10 mM EDTA e centrifugato a 20.000 g per 20 min. Then, 500 μ l of the supernatant was mixed with 500 μ l of 0.2 M sodium L-aspartate and incubated at 37°C for 60 min. Poi, 500 μ l di surnatante è stato mescolato con 500 μ l di sodio 0,2 M e L-aspartato incubate a 37 ° C per 60 min. A blank was prepared as a sample, but incubated at 0°C (ice water) instead of 37°C, for 60 min. Un vuoto è stato preparato come un campione, ma incubate a 0 ° C (acqua ghiacciata) invece di 37 ° C, per 60 min. After incubation, 200 μ l of 1.0 M TCA was added, and the solution was mixed and centrifuged for 10 min at 20,000 g. Dopo l'incubazione, 200 μ l di 1,0 M TCA è stato aggiunto, e la soluzione è stato mixato e centrifugato per 10 minuti a 20.000 g.

Step 2: 1 ml of each supernatant (sample and blank) was neutralized with 80-90 μ l of 2.0 M NaOH and mixed with 100 μ l Tris-HCl 1 M, pH 8.2 and 5 μ l of purified D-AspO (2 mg/ml; 300 U/ml), obtained by over-expression from beef kidney Fase 2: 1 ml di ciascun supernatante (campione e del bianco) è stato neutralizzato con 80-90 μ l di NaOH 2,0 M e mescolato con 100 μ l Tris-HCl 1 M, pH 8,2 e 5 l μ di purificato D-Aspo (2 mg / ml, 300 U / ml), ottenuto da un eccesso di espressione a partire da carni di rene [ 8 ] or from the hepathopancreas of Octopus vulgaris [8] o dal hepathopancreas di Octopus vulgaris [ 2 ] and incubated for 30 min at 37°C in order to oxidize the D-Asp in α -oxaloacetate. [2] e incubate per 30 minuti a 37 ° C, al fine di ossidare il D-Asp in α-ossalacetato. After that, 100 μ l of 5.0 mM 2,4-dinithrophenylhydrazine (in 5 M HCl) was added, mixed and left at room temperature for 10 min. Dopo di che, 100 μ l di 5,0 2,4 mm-dinithrophenylhydrazine (in 5 M HCl) è stato aggiunto, misti e lasciato a temperatura ambiente per 10 min. Finally, 200 μ l of 5 M NaOH was added and mixed, and the absorbance of the sample was read against the blank at 445 nm. Infine, 200 μ l di 5 M NaOH è stato aggiunto e misti, e l'assorbanza del campione è stato letto contro il bianco a 445 nm. In order to determine the amount of D-Asp in the 1 ml of the above supernatant, a standard test of D-Asp was carried out. Al fine di determinare la quantità di D-Asp in 1 ml del surnatante di cui sopra, un test standard di D-Asp è stata effettuata. For this purpose, 1.0 ml of 0.01 mM of sodium D-aspartate was mixed with 100 μ l of H 2 O, 100 μ l Tris-HCl 1 M, pH 8.2 and 5 μ l of purified D-AspO and the procedure was continued as sample. A tal fine, 1,0 ml di 0,01 mm di sodio D-aspartato è stato mescolato con 100 μ l di H 2 O, 100 μ l Tris-HCl 1 M, pH 8,2 e 5 l μ di purificato D-Aspo e la procedura è proseguita come campione. The absorbance of this standard was read against a blank in which 1.0 ml H 2 O was used instead of D-aspartate. L'assorbanza di questa norma è stata letta nei confronti di un vuoto in cui 1,0 ml di H 2 O è stato usato al posto di D-aspartato. One enzyme unity (EU) was defined as the amount of the enzyme capable of generating 1 nmol of D-Asp in 60 min of incubation at 37°C in the above assay conditions. Una unità di enzimi (UE) è stata definita come la quantità di un enzima in grado di generare 1 nmol di D-Asp in 60 min di incubazione a 37 ° C nelle condizioni di cui sopra test. The specific activity was defined as the EU/mg of the homogenate. L'attività specifica è stata definita come l'UE / mg di omogenato.
Statistical analysis Analisi statistica

Results are presented as the mean ± SEM. I risultati sono presentati come media ± SEM. LH and testosterone concentrations in human serum were analyzed by analysis of variance with repeated measurements (ANOVA, StatView). LH e le concentrazioni di testosterone nel siero umano sono stati analizzati mediante analisi della varianza con misure ripetute (ANOVA, Statview). D-Asp storage in rat tissues and LH and testosterone concentration from in vivo and in vitro experiments on rats were analyzed by one-way ANOVA. D-Asp di stoccaggio nei tessuti di ratto e di LH e la concentrazione di testosterone in vivo e in esperimenti in vitro su ratti sono stati analizzati da one-way ANOVA. Pairwise comparison of the means was made with Fisher's LSD test. Confronto di coppie dei mezzi è stato effettuato con test di Fisher LSD. Values of p < 0.05 were considered significant. Valori di p <0,05 sono stati considerati significativi.
Results Risultati
Specific determination of D-aspartic acid by HPLC-D-AspO Determinazione specifica di acido D-aspartico HPLC-D-Aspo

The determination of free D-Asp in the sample was carried out using an HPLC method associated with the use of D-aspartate oxidase (D-AspO), as previously reported La determinazione del libero D-Asp nel campione è stata effettuata utilizzando un metodo HPLC associato con l'uso di D-aspartato ossidasi (D-Aspo), come precedentemente segnalato [ 8 ]. [8]. Fig. Fig. 1 shows a typical HPLC analysis of a standard mixture of amino acids and a biological sample. 1 mostra una tipica analisi HPLC di una miscela standard di aminoacidi e di un campione biologico. Panel A shows the HPLC analysis of a mixture consisting of 20 pmoles of D-Asp and 50 pmoles of various L-amino acids. Un pannello mostra l'analisi HPLC di una miscela composta di 20 pmoli di D-Asp e 50 pmoli di vari L-amminoacidi. Panel B, shows the same HPLC analysis of the amino acid standard mixture, but after treatment with D-AspO. Pannello B, mostra l'analisi HPLC stesso l'aminoacido miscela standard, ma dopo il trattamento con D-Aspo. Panel C shows the HPLC analysis of free amino acids from 0.05 mg of a rat hippocampus; and panel D shows the same sample, but after treatment with D-AspO. Pannello C mostra l'analisi HPLC di amminoacidi liberi da 0.05 mg di un ippocampo di ratto, e il pannello D mostra lo stesso campione, ma dopo il trattamento con D-Aspo. This figure shows that in both the standard mixture (panel B) and the sample (panel D) the peak of D-Asp disappeared completely after the incubation of these samples with D-AspO, indicating that the peak of D-Asp was completely due to D-Asp in the standard mixture or in the sample, respectively. Questo dato dimostra che, in entrambi la miscela standard (pannello B) e il campione (pannello D), il picco di D-Asp scomparve completamente dopo l'incubazione di questi campioni con D-Aspo, indicando che il picco di D-Asp è stato completamente dovuta di D-Asp nella miscela standard o nel campione, rispettivamente.

anteprima Figure 1. Typical HPLC analysis of D-Asp and other amino acids from rat pituitary gland . Figura 1. HPLC tipici di D-Asp e di altri aminoacidi dal ratto ghiandola pituitaria. Panel A, HPLC profile of amino acids from a standard mixture consisting of 50 pmoles of D-Asp and 100 pmoles of various L-amino acids. Un pannello, profilo HPLC degli aminoacidi da una miscela standard composto da 50 pmoli di D-Asp e 100 pmoli di vari L-amminoacidi. Panel B is the HPLC analysis of the same amino a cids, but after treatment with D-AspO. Pannello B è l'analisi HPLC della stessa amino uno CID, ma dopo il trattamento con D-Aspo. Panel C shows the HPLC analysis of free amino acids from 0.05 mg of rat hippocampus, and panel D is the same sample, but after treatment with D-AspO. Pannello C mostra l'analisi HPLC di amminoacidi liberi da 0.05 mg di ippocampo di ratto, e il quadro D è lo stesso campione, ma dopo il trattamento con D-Aspo. The peak of D-Asp disappeared completely after incubation of the sample with D-AspO (panels B and D), indicating that the peak area of D-Asp was completely due to D-Asp. Il picco di D-Asp scomparve completamente dopo l'incubazione del campione con D-Aspo (pannelli B e D), indicando che l'area del picco del D-Asp è stato completamente a causa di D-Asp.
Effects of D-aspartate on LH and testosterone release in humans Gli effetti del D-aspartato On LH e il rilascio di testosterone nell'uomo

In this study 23 participants took an oral dose of sodium D-aspartate (DADAVIT ® ) for 12 consecutive days and 20 participants took an oral dose of placebo (DADAVIT ® placebo) for 12 consecutive days; the levels of LH and testosterone in the serum were monitored after 6 and 12 days of treatment and 3 days after suspension of the treatment (with D-aspartate or the placebo). In questo studio 23 partecipanti hanno preso una dose orale di sodio D-aspartato (DADAVIT ®) per 12 giorni consecutivi e 20 partecipanti hanno preso una dose orale di placebo (placebo DADAVIT ®) per 12 giorni consecutivi, i livelli di LH e testosterone nel siero sono stati controllati dopo 6 e 12 giorni di trattamento e 3 giorni dopo la sospensione del trattamento (con D-aspartato o il placebo).

Concerning the LH pattern, the results demonstrated that after 12 days of D-Asp treatment, 20 out of 23 (87%) participants had significantly increased concentrations of LH in their blood with respect to basal values (the value of LH found in the same subjects before starting treatment). Per quanto riguarda il modello LH, i risultati hanno dimostrato che dopo 12 giorni di D-Asp di trattamento, 20 su 23 (87%), i partecipanti hanno avuto un significativo aumento delle concentrazioni di LH nel sangue rispetto ai valori basali (il valore di LH trovato nella stessa soggetti prima di iniziare il trattamento). Statistical analysis demonstrated that the value (mean ± SEM) of serum calculated for all the 23 subjects treated with D-Asp increased by 33.3%. L'analisi statistica ha dimostrato che il valore (media ± SEM) di siero calcolato per tutti i 23 soggetti trattati con D-Asp è aumentato del 33,3%. From a basal-level mean of 4.2 ± 0.5 mIU/ml, LH rose to a mean value of 5.6 ± 0.9 mIU/ml (Table Da un livello basale medio di 4,2 ± 0,5 mUI / ml, LH è salito a un valore medio di 5,6 ± 0,9 mUI / ml (Tabella 1 ). 1). The increase was statistically significant (ANOVA with repeated measures: [F (2,82) = 24.279, p < 0.0001]). L'aumento è stato statisticamente significativo (ANOVA con misure ripetute: [F (2,82) = 24,279, p <0,0001]). LH concentration determined in the placebo group after D-Asp treatment compared with the level before treatment had not increased [ANOVA: F (1,82) = 0.643, p > 0.427]), thus indicating that the increase of LH due to D-aspartate treatment was authentic. Concentrazione di LH determinati nel gruppo placebo dopo il D-Asp di trattamento rispetto al livello di prima del trattamento non aveva aumentato [ANOVA: F (1,82) = 0,643, p> 0,427]), indicando così che l'aumento di LH a causa di D - trattamento aspartato era autentico. The effect of D-aspartate on LH increase was time dependent. L'effetto di D-aspartato in aumento LH era tempo dipendente. When subjects drank sodium D-aspartate for 6 days, LH increased only 1.07-fold, and this value was not statistically significant (Table Quando i soggetti bevevano sodio D-aspartato per 6 giorni, LH aumentato solo 1,07 volte, e questo valore non è risultata statisticamente significativa (Tabella 1 ). 1). However, when the treatment of D-Asp was continued for 12 consecutive days, the LH concentration in the serum increased significantly (benefit effects). Tuttavia, quando il trattamento di D-Asp è stato continuato per 12 giorni consecutivi, la concentrazione di LH nel siero aumentato in misura significativa (effetti benefici). In order to know how long LH remained increased in the blood after the suspension of the treatment, we measured the concentration of LH in the serum 3 days after the D-Asp treatment or the placebo treatment was suspended. Al fine di sapere quanto tempo è rimasto LH aumentato nel sangue dopo la sospensione del trattamento, abbiamo misurato la concentrazione di LH nel siero 3 giorni dopo il D-Asp trattamento o il trattamento con placebo è stata sospesa. The results indicated that 3 days after suspension of D-Asp treatment, LH was still found at a 1.14-fold increased levels compared with the respect of basal level, but not statistically significant (Table I risultati hanno indicato che 3 giorni dopo la sospensione del trattamento di D-Asp, LH è stato ancora trovato a 1,14 volte i livelli aumentati rispetto al rispetto del livello basale, ma non statisticamente significativa (Tabella 1 ). 1).

Table 1. Effects of D-aspartate on LH and testosterone release in human serum Tabella 1. Effects of D-aspartato On LH e il rilascio di testosterone nel siero umano

Concerning the effect of D-Asp on the induction of testosterone release, after 12 days of D-Asp treatment, the levels of testosterone in the serum of the participants were significantly increased compared with basal levels. Per quanto riguarda l'effetto di D-Asp per l'induzione del rilascio di testosterone, dopo 12 giorni di D-Asp di trattamento, i livelli di testosterone nel siero dei partecipanti è risultata significativamente maggiore rispetto ai livelli basali. Out of 23 participants, 20 had increased testosterone. Su 23 partecipanti, 20 erano aumentati di testosterone. From a mean of 4.5 ± 0.6 ng/ml serum at zero time, it rose to 6.4 ± 0.8 ng/ml, a 42% increase (Table Da una media di 4,5 ± 0,6 ng / ml di siero al tempo zero, è salito a 6,4 ± 0,8 ng / ml, un incremento del 42% (Tabella 1 ). 1). Statistical analyses indicated a significant effect [ANOVA with repeated measures: treatment effect: F (1,82) = 7.724, p < 0.0082] and a significant interaction between treatment and days [F (2,82) = 32.599; P < 0.0001]. Le analisi statistiche hanno indicato un effetto significativo [ANOVA con misure ripetute: effetto del trattamento è: F (1,82) = 7,724, p <0,0082] e una interazione significativa tra trattamento e giorno [F (2,82) = 32,599, P <0,0001] . As with LH, so also with testosterone, the effect of D-aspartate was time dependent. Come con LH, così anche con il testosterone, l'effetto di D-aspartato era tempo dipendente. When subjects were treated with sodium-D-aspartate for only 6 days, testosterone was found of 1.15-fold higher than basal levels, but this increase was not statistically significant (Table Quando i soggetti sono stati trattati con sodio-D-aspartato per soli 6 giorni, il testosterone è risultato di 1,15 volte superiore ai livelli basali, ma questo aumento non era statisticamente significativa (Tabella 1 ). 1). Interestingly 3 days after the suspension of D-Asp treatment, testosterone was still increased 1.22-fold compared with the basal levels (5.8 ± 0.6 ng/ml against 4.5 ± 0.6 ng/ml). È interessante notare che 3 giorni dopo la sospensione del trattamento di D-Asp, il testosterone era ancora aumentato 1,22 volte rispetto ai livelli basali (5.8 ± 0.6 ng / ml contro 4,5 ± 0,6 ng / ml). Fisher's post-hoc analysis also revealed a significant difference in the testosterone concentration in the serum 3 days after the end of the treatment (p < 0.01) (Table Post-hoc di Fisher analisi ha inoltre evidenziato una significativa differenza nella concentrazione di testosterone nel siero 3 giorni dopo la fine del trattamento (p <0.01) (Tabella 1 ). 1). One plausible explanation of this phenomenon is that since in rats ingested D-Asp remains accumulated in the testes in significant amounts until 3 days after the suspension of D-Asp treatment (see below), if it is assumed that in humans D-Asp also remains significantly increased in the testes 3 days after the suspension of D-Asp treatment, we can deduce that in humans as in rats, D-Asp had remained accumulated in significant amounts in the testes and consequently it continued to stimulate testosterone release. Una spiegazione plausibile di questo fenomeno è che, poiché nel ratto ingerito D-Asp rimane accumulata nei testicoli in quantità significativa fino a 3 giorni dopo la sospensione del trattamento di D-Asp (vedi sotto), se si considera che negli esseri umani D-Asp anche rimane significativamente aumentata nei testicoli 3 giorni dopo la sospensione del trattamento di D-Asp, possiamo dedurre che negli esseri umani, come nei ratti, D-Asp era rimasta accumulati in quantità significativa nei testicoli e di conseguenza, ha continuato a stimolare il rilascio di testosterone.
Effects of D-aspartate on the release of LH and testosterone in rats Gli effetti del D-aspartato sul rilascio di LH e testosterone nel ratto

When rats drank a solution of 20 mM sodium D-aspartate for 12 days, the concentration of LH and testosterone in the serum increased significantly. Quando ratti bevuto una soluzione di 20 mm di sodio D-aspartato per 12 giorni, la concentrazione di LH e testosterone nel siero è aumentato notevolmente. After treatment, the level of LH in the rats' serum was increased by 51% compared with that of the controls. Dopo il trattamento, il livello di LH nel siero dei topi 'stata aumentata del 51% rispetto a quello dei controlli. From a mean LH value of 3.7 ± 0.3 mIU/ml for the controls, it increased to a value of 5.6 ± 0.4 mIU/ml, a 1.51-fold increase (p < 0.001) (Table Da un valore medio di 3,7 ± LH 0,3 mUI / ml per i controlli, è aumentata ad un valore di 5,6 ± 0,4 mUI / ml, a 1,51 volte maggiore (p <0,001) (Tabella 2 ). 2). Three days after the suspension of the treatment, LH concentration still remained increased compared with the control rats but the difference was not statistically significant (Table Tre giorni dopo la sospensione del trattamento, la concentrazione di LH rimaneva ancora maggiore rispetto ai ratti di controllo, ma la differenza non era statisticamente significativa (Tabella 2 ). 2).

Table 2. Effects of D-aspartate on LH and testosterone release in rat serum Tabella 2. Effects of D-aspartato siero di LH e il rilascio di testosterone nel ratto

Concerning testosterone, the effect of sodium D-aspartate on testosterone release in rat serum was to induce a 2.05-fold increase of this hormone; from a basal level of 5.1 ± 0.8 ng/ml in the control rats, testosterone reach the level of 10.4 ± 1.2 ng/ml in treated animals (p < 0.001) (Table Per quanto riguarda il testosterone, l'effetto di sodio D-aspartato il rilascio di testosterone nel siero di ratto era quello di indurre un 2,05 volte l'aumento di questo ormone, da un livello basale di 5,1 ± 0,8 ng / ml nei ratti di controllo, il testosterone raggiungere il livello di 10,4 ± 1,2 ng / ml negli animali trattati (p <0,001) (Tabella 2 ). 2). It is interesting to observe that, contrary to what occurred with LH, three days after the suspension of the treatment, testosterone levels still remained significantly increased compared with the control rats: a 1.27-fold increase (p < 0.01) (Table E 'interessante osservare che, contrariamente a quanto era avvenuto con LH, tre giorni dopo la sospensione del trattamento, i livelli di testosterone rimaneva significativamente aumentata rispetto ai ratti di controllo: a 1,27 volte maggiore (p <0.01) (Tabella 2 ). 2).

The effect of D-Asp on the increased release of testosterone in serum that occurs 3 days after suspension of the treatment may be due to two events: i) the increase of testosterone in serum is a consequence of the increased LH, which in turn stimulates the release of testosterone in the testes; and ii) D-Asp also has a direct action on the testes in enhancing testosterone release, as already demonstrated both previously L'effetto di D-Asp sul rilascio maggiore di testosterone nel siero che si verifica 3 giorni dopo la sospensione del trattamento può essere dovuta a due eventi: i) l'aumento di testosterone nel siero è una conseguenza di un aumento di LH, che a sua volta stimola il rilascio di testosterone nei testicoli, e ii) D-Asp ha anche un azione diretta sulla testicoli nel migliorare rilascio di testosterone, come già dimostrato in precedenza, sia [ 5 , 13 ] and also by this study (see below). [5, 13], e anche da questo studio (vedi sotto). In addition, since the ingested D-Asp also still remains accumulated significantly in the testes 3 days after D-Asp suspension of treatment (this study), we deduce that the persistent increase of testosterone in rat blood is due to the accumulation of D-Asp that persists leading to stimulated testosterone production. Inoltre, poiché l'ingestione di D-Asp inoltre rimane accumulata in modo significativo nei testicoli 3 giorni dopo il D-Asp sospensione del trattamento (questo studio), si deduce che il costante aumento di testosterone nel sangue di ratto è dovuta all'accumulo di D - asp che persiste più a stimolare la produzione di testosterone.
Occurrence and accumulation of D-aspartate in rat tissues following D-Asp treatment Occorrenza e l'accumulo di D-aspartato nei tessuti del ratto dopo trattamento D-Asp

The results obtained from this experiment demonstrated that D-Asp occurs naturally at a comparatively higher concentration in the pituitary gland, where the mean concentration was found to be 129 ± 12 nmol/g tissue (Table I risultati ottenuti da questo esperimento ha dimostrato che il D-Asp si trova naturalmente a una concentrazione relativamente più elevata nella ghiandola pituitaria, dove la concentrazione media è risultata 129 ± 12 nmol / g di tessuto (Tabella 3 ), followed by the testes (109 ± 8 nmol/g tissue), followed by other tissues (Table 3), seguiti dai testicoli (109 ± 8 nmol / g di tessuto), seguita da altri tessuti (Tabella 3 ). 3). After treatment with D-Asp for 12 days, D-Asp was found to be accumulated in all the rat tissues examined (Table Dopo il trattamento con D-Asp per 12 giorni, D-Asp è risultato essere accumulata in tutti i tessuti del ratto ha esaminato (Tabella 3 ). 3). However, the pituitary, the testes and the thyroid were the tissues in which this amino acid was accumulated in the greatest amounts. Tuttavia, l'ipofisi, i testicoli e della tiroide sono stati i tessuti in cui questo aminoacido è stato accumulato negli importi maggiori. In the pituitary, in fact, D-Asp was increased 6.8-fold compared with the basal levels (Table Nella ghiandola pituitaria, infatti, D-Asp è stato aumentato 6,8 volte rispetto ai livelli basali (Tabella 2 ). 2). In the testes D-Asp was increased 7.15-fold compared within to the basal levels. Nei testicoli D-Asp è stato aumentato 7,15 volte rispetto ai livelli basali al. However we found that in all rat tissues 12 hours after from D-Asp treatment, D-Asp was found accumulated at a level that was 2-3 times greater than the basal levels (Table Però abbiamo scoperto che in tutti i tessuti di ratto 12 ore dopo il trattamento da D-Asp, D-Asp è stato trovato accumulate ad un livello che è 2-3 volte superiore ai livelli basali (Tabella 3 ). 3).

Table 3. Endogenous occurrence of D-aspartate in rat tissues and accumulation after treatment with sodium D-aspartate Tabella 3. Verificarsi endogena di D-aspartato nei tessuti di ratto e di accumulo dopo il trattamento con sodio D-aspartato
Effects of D-aspartate on the synthesis of LH and cGMP in the isolated rat pituitary Gli effetti del D-aspartato sulla sintesi di LH e cGMP nella ghiandola pituitaria isolati di ratto

In vitro experiments carried out on the isolated pituitary gland demonstrated that when the gland is incubated with 0.1 mM D-Asp, a significantly increased (1.8-fold) the synthesis of LH occurs. Gli esperimenti in vitro effettuata sulla ghiandola pituitaria isolati hanno dimostrato che quando la ghiandola è incubato con 0,1 mm D-Asp, un significativo aumento (1,8 volte), la sintesi di LH si verifica. In fact, whereas the control sample contained an LH value of 250 ± 8 mIU/mg protein, in the sample incubated with D-Asp, the LH concentration rose to 480 ± 11.4 mIU/mg, p < 0.001) (Fig. In effetti, considerando che il campione di controllo conteneva un valore di LH di 250 ± 8 mUI / mg di proteina, nel campione incubati con D-Asp, la concentrazione di LH è salito a 480 ± 11,4 mUI / mg, p <0,001) (Fig. 2 , left panel). 2, pannello a sinistra). The same effects occurred also when the concentration of D-Asp in the medium was 1.0 mM. Gli stessi effetti si è verificato anche quando la concentrazione di D-Asp nel medio era 1,0 mm. In this case the increased LH synthesis was enhanced 2.32-fold (from 250 ± 8 mIU/mg of protein to 580 ± 19.7 mIU/mg) (A, B: p < 0.001; a, b: p < 0.02), but the increase was not proportionate to the concentration of D-Asp (Fig. In questo caso la sintesi è stata rafforzata LH aumentato 2,32 volte (da 250 ± 8 mUI / mg di proteina a 580 ± 19,7 mUI / mg) (A, B: p <0,001; a, b: p <0.02), ma il aumento non è stato proporzionale alla concentrazione di D-Asp (Fig. 2 , left panel). 2, pannello a sinistra). In this experiment we also measured the concentration of cAMP and cGMP in the medium in which the pituitary gland was incubated with D-Asp and found that the concentration of cGMP was significantly increased. In questo esperimento abbiamo anche misurato la concentrazione di cAMP e cGMP nel mezzo in cui la ghiandola pituitaria è stato incubato con D-Asp e ha riscontrato che la concentrazione di cGMP era significativamente aumentato. A concentration of 0.1 mM D-Asp in 60 min of incubation induced a significant increase in the synthesis of cGMP it raised 2.5-fold, from a value of 1.0 ± 0.2 pmol/mg tissue to 2.5 ± 0.4 pmol/mg tissue (Fig. Una concentrazione di 0,1 mm D-Asp in 60 min di incubazione ha indotto un significativo aumento nella sintesi di cGMP ha sollevato 2,5 volte, da un valore di 1.0 ± 0.2 pmol / mg di tessuto a 2,5 ± 0,4 pmol / mg di tessuto (Fig. 2 , right panel). 2, pannello di destra). D-Asp at the concentration of 1.0 mM in the medium induced a 3.1-fold increase in the synthesis of cGMP (A, B and C, D: p < 0.0001) (Fig. D-Asp alla concentrazione di 1,0 mm nel medio indotto uno 3,1 volte l'aumento della sintesi di cGMP (A, B e C, D: p <0,0001) (Fig. 2 , right panel). 2, pannello di destra). However, the increase was not proportional to D-Asp concentration, thus indicating that the minimum concentration of 0.1 mM is already sufficient to stimulate the pituitary to synthesize cAMP; this is similar to the effects of other described molecules on the pituitary gland Tuttavia, l'aumento non è proporzionale alla concentrazione di D-Asp, indicando così che la concentrazione minima di 0,1 mm è già sufficiente a stimolare l'ipofisi a sintetizzare cAMP, questo è simile agli effetti di altre molecole descritte sulla ghiandola pituitaria [ 27 - 29 ]. [27 - 29].

anteprima Figure 2. Effects of D-Asp on LH and cGMP synthesis in isolated rat pituitary glands . Figura 2. Effects of D-Asp On LH e la sintesi di cGMP nel ratto isolati ipofisi. Pituitary glands were incubated at 37°C for 60 min in a medium with Na-D-aspartate 0.1 or 1.0 mM and then LH and cGMP levels were determined in the total gland homogenate plus medium. Ipofisi sono state incubate a 37 ° C per 60 minuti in un mezzo di Na-D-aspartato 0,1 o 1,0 mm e quindi i livelli di LH e di cGMP sono stati determinati in omogenati totale della ghiandola più medium. The left panel shows that the increase of LH (LH synthesis) due to the action of the two concentrations of D-Asp versus the control (pituitary incubated without D-Asp): A, B (p < 0.001); a, b (p < 0.02). The right panel shows the total concentration of cGMP determined in the same samples as above obtained (cGMP synthesis): A, B and C, D(p < 0.001). Results are the mean ± SEM obtained from 5 individual experiments. Asterisks indicate that the difference in value between treated rats and control rats was significant at p < 0.0001, evaluated by one-way ANOVA.
Effects of D-aspartate on the synthesis of testosterone and cAMP in rat Leydig cells

When Leydig cells obtained from rat testes were incubated with 0.1 mM D-Asp, there was a significant 2.4-fold increase in the synthesis of testosterone. From a basal value of 34 ± 3 ng testosterone/10 6 in Leydig cells, after D-Asp treatment, testosterone was raised to 82 ± 3 ng/10 6 cells (A, B: p < 0.001) (Fig. 3 , left panel). When the concentration of D-Asp was 1.0 mM in the medium, the increase was 2.94-fold compared with the control (C, D: p < 0.001) (Fig. 3 , left panel). Thus, as occurred with LH synthesis in the pituitary gland, in Leydig cells the concentration of 0.1 mM D-Asp also induced testosterone synthesis significantly. We looked for the action of D-Asp on the second messenger and found that following treatment of Leydig cells with 0.1 mM D-Asp, cAMP was increased 3.1-fold compared with the control. When D-Asp was administered at a levels of 0.1 mM in the medium, from a value of 20 ± 3.0 pmol/10 6 in Leydig cells in the control, cAMP rose to 62 ± 8.1 pmol/10 6 (p < 0.001) (Fig. 3 , right panel). When D-Asp was administered at a level of 1.0 mM in the medium, a 5.25-fold increase was observed (20 ± 3.0 pmol/10 6 compared with 105 ± 3.3 pmol/10 6 after stimulation) (p < 0.0001) (Fig. 3 , right panel). These results thus mirrored the previously reported data in which it was demonstrated that the stimulation of Leydig cells is accompanied by an increase in cAMP [ 30 ]. [30].

anteprima Figure 3. Effects of D-Asp on the synthesis of testosterone and cAMP in isolated rat Leydig cells . 1 ml of purified Leydig cells (1.0 × 10 6 cells) was incubated at 37°C for 60 min with Na-D-Asp 0.1 or 1.0 mM and control and then the testosterone and cAMP synthesis was determined. The left panel shows the total production of testosterone in the medium plus the Leydig cell homogenate, in the control sample and in the samples incubated with 0.1 mM or with 1.0 mM D-Asp: A, B and C, D (p < 0.001). The right panel shows the concentration of cAMP in the same above samples: A, B and C, D (p < 0.001). Values are the mean ± SEM obtained from 5 individual experiments. Asterisks indicate that the increased levels were significant compared with the controls at p < 0.001 as evaluated by one-way ANOVA.
Biosynthesis of D-aspartate in rat tissues: D-aspartate racemase

The presence of D-Asp in rat tissues leads to the question of the origin of D-Asp. In order to determine whether D-Asp is biosynthesized in vivo by conversion of L-Asp to D-Asp, we incubated a sample homogenized with L-Asp and then measured the D-Asp generated. We have termed the enzyme which converts L-Asp into D-Asp "D-aspartate racemase". The results obtained from this investigation have demonstrated that this enzyme is present in many rat tissues, and that of the investigated tissues (pituitary, testes, brain, liver, kidney and serum), the pituitary gland is the tissue which contains the highest enzymatic activity, with 20 ± 3.0 EU/mg protein, followed by: testis; brain, liver, kidney and serum (Fig. 4 ). 4). In addition, it is also interesting to observe that the D-aspartate racemase activity is greater in those tissues in which D-Asp also occurs at the higher levels.

anteprima Figure 4. D-Aspartate racemase activity in rat tissues: Synthesis of D-Asp . Homogenized tissue were incubated with L-Asp for 60 min at 37°C and then the amount of D-Asp synthesized was detected. The D-Asp that developed was determined by a colorimetric method based on the use of D-AspO. One enzyme unity (EU) was defined as the amount of the enzyme capable of generating 1 nmol of D-Asp in 60 min of incubation at 37°C and in the above assay conditions. The specific activity was defined as the EU/mg protein. The values are the mean ± SEM as obtained from five determinations, each carried out on a different rat.
Discussion Discussione

In this study using a specific HPLC method combined with the use of D-AspO (Fig. 1 ) and specific immunoenzymatic methods for the determination of LH and testosterone as well as of the second messengers, cAMP and cGMP, we have demonstrated that D-aspartic acid plays a role in the release and synthesis of LH and testosterone in humans and rats. In humans we found that with the consumption of a daily dose of 10 ml of 2 M sodium D-aspartate solution (3.12 g) for 12 consecutive days, the levels of LH and testosterone in the serum were significantly increased, by 33% and 42% respectively. In 87% of the subjects who have been treated with sodium D-aspartate increased the concentration of LH and testosterone in the serum (p < 0.0001). After 6 days of treatment LH was already found to have increased, but this increase was not statistically significant (Table 1 ). Three days after sodium D-aspartate suspension, LH still was found higher than that of basal levels (a 1.14-fold increased), but this increase was not statistically significant (Table 1 ), indicating that the increase of LH was dose dependent. The consumption of sodium D-aspartate in humans also induced significant testosterone release in the serum. In fact, in the same subjects who took D-Asp for 12 days, the levels of testosterone increased significantly. ANOVA with repeated measurements indicated a significant value (p < 0.0001). As with LH, so also with testosterone, 6 days of treatment induced increased serum testosterone in the blood, but this increase was not significant. Interestingly, contrary to what occurred for LH, three days after suspension of the treatment, testosterone still remained increased in the serum 1.28-fold increase compared with the basal levels, and this increase was significant (p < 0.01) (Table 1 ). A possible explanation of this event is that the ingested D-Asp probably also remained accumulated in the testes 3 days after treatment was stopped, and it continued to stimulate the testosterone production in the testes. This hypothesis is supported by results obtained in rats. In fact, after rats had drunk a solution of 20 mM D-Asp for 12 days, this amino acid had accumulated in various tissues, especially the pituitary and the testes (Table 3 ). 3). However, when D-Asp treatment was suspended, D-Asp that had accumulated in tissues diminished until it reached basal levels, except in the testes, where D-Asp still remained significantly increased 1.88 fold (Table 3 ). 3).

In this study we used rats as model animals in order to understand the molecular mechanism by which D-Asp induce its action. Rats were allowed to drink a solution of sodium D-Asp for 12 days and after that the concentration of D-Asp that accumulated in tissues was determined along with the concentration of LH and testosterone. In rat as in humans, D-Asp also actively induced LH and testosterone release. In fact, when rats were treated with D-Asp, a significant increase in LH and testosterone was observed after the 12 days of treatment (Table 2 ), coinciding with the increased levels of D-Asp in the pituitary and testis respectively (Table 2 ). 2). Thus, these data indicate that D-Asp is involved in the regulation of the above hormones.

In vitro experiments conducted on an isolated rat pituitary incubated with D-Asp demonstrated that D-Asp at the concentration of 0.1 mM in the medium is capable of inducing the synthesis of LH (Fig. 2 , left panel) and testosterone (Fig. 3 , left panel). In addition, when the pituitary gland was incubated with 0.1 mM D-Asp, a significant increase of cGMP occurred in the assay mixture (Fig 3 , right panel) thus indicating that the release and synthesis of LH occurred under the intervention of the cGMP. These data are in agreement with previous results obtained by other investigators [ 27 - 29 ], who demonstrated that the molecule involved in the signal transduction for other metabolites in the rat pituitary was cGMP. Similarly, in vitro experiments conducted on isolated Leydig cells incubated in a medium containing 0.1 mM of sodium D-Asp demonstrated that this amino acid is capable of inducing the synthesis of testosterone (Fig. 3 , left panel) and that this event is mediated by cAMP, which acts as the molecule involved in the signal transduction for testosterone synthesis from rat Leydig cells (Fig. 3 , right panel). Also, this last result is in agreement with previous studies by other investigators in which it was demonstrated that the increase of testosterone synthesized by Leydig cells occurs under the intervention of the cAMP [ 30 ]. The final concern of this study was to examine the biosynthesis of D-Asp in the pituitary and testis. The results demonstrated that rat tissues contain a racemase activity that is capable of converting L-Asp into D-Asp. We have termed this enzyme "D-aspartate racemase" and it is present in all the rat tissues we analyzed. The pituitary and the testis are the tissues with higher concentrations (Fig. 4 ). 4). These data thus indicate that a relationship exists between the endogenous concentration of D-Asp and the concentration of the D-aspartate racemase in the tissues (Fig. 4 ). 4).

In this study, we also investigated the action of L-Asp on hormone release in rats. A group of 10 male rats were treated with L-Asp instead of D-Asp at the same time and at the same concentration and then levels of LH and testosterone in the blood were determined. The results of this investigation indicated that the L-Asp does not induce any significant increase of serum LH or testosterone (data not shown), thus indicating thus that only the stereochemical form of D-Asp is active in the hormone release.
Conclusion Conclusione

Here we demonstrated that D-aspartic acid, which occurs as a physiological compound in the mammalian pituitary and testis, has a role in the regulation of the release and synthesis of LH and testosterone. In humans and rats, sodium D-Asp treatment enhances the release of LH and testosterone. The experiments that we carried out on rats have permitted us to understand that this amino acid regulates the synthesis of LH and testosterone in the pituitary and the testis respectively. This action is mediated in the pituitary by cGMP and in the testis by cAMP, which act as the second messengers in the signal transduction in the pituitary and testes respectively. The pituitary and testis possesses a D-Aspartate racemase, which provides the necessary production of D-Asp.
Abbreviations Abbreviazioni

(LH): Luteinizing hormone; (D-Asp): D-aspartic acid; (HPLC): High performance liquid chromatography; (TCA): trichloroacetic acid; (IVF): in vitro fertilization; (DADAVIT ® ): Commercial integrator consisting of sodium D-aspartate and vitamins, produced by the 'Pharmaguida srl, Italy'; (cGMP): cyclic guanosine monophosphate; 3',5'-cyclic guanosine monophosphate; (cAMP): cyclic adenosine monophosphate; 3',5'-cyclic adenosine; (PBS): phosphate buffer saline.
Competing interests Interessi in competizione

The authors declare that they have no competing interests.
Authors' contributions Contributi di autori '

ET and ADA participated in amino acids analysis by HPLC, treatment of rats with sodium D-Asp and placebo, determination of hormone analysis, preparation of rat pituitary slices and Leydig cells, analysis of cAMP, cGMP and racemase activity at the Zoological Station of Naples. AS participated in the determination of hormones in serum at the Fondazione IRCCS-SDN). SR and GDA oversaw recruitment of human subjects (volunteers) at the Department of Reproductive Medicine (IVF Unit), Hospital 'S. Luca', Vallo della Lucania, Italy). GDA, ET and ADA designed the experiments and prepared the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.
Acknowledgements Ringraziamenti

This work was supported by the Department of Obstetrics and Gynecology, and Reproductive Medicine (IVF Unit), Hospital 'S. Luca', 84078 Vallo della Lucania, Italy; by the Zoological Station Anton Dohrn, Napoli, Italy, and by the Fondazione IRCCS-SDN, Via Gianturco 113, 80143 Napoli, Italy.
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[greatescape]

Acido D-aspartico si forma quando il racemasi dell'enzima aspartato converte l'acido L-aspartico in D-acido aspartico nei testicoli e altre ghiandole. Questo aminoacido svolge un ruolo chiave nella produzione di spermatozoi e degli ormoni sessuali. È per questo che la società italiana di prodotti farmaceutici Pharmaguida mercati l'aminoacido in prodotti come Dadavit, che si rivolge a uomini infertili.

I ricercatori hanno dato un paio di dozzine di uomini di età compresa tra 27 e 37 una dose giornaliera di 3,12 grammi di acido D-aspartico per dodici giorni consecutivi. Venti uomini sono stati forniti altri un placebo. Il livello di testosterone nei soggetti che hanno ricevuto il supplemento era aumentato del 33 per cento, dopo dodici giorni.

[greatescape]

questi testi sono stati tradotti con google translator per chi si volesse leggere gli studi originali tipo doc o manakei do il link .. gli studi sembrano completi e gratis
interessante il fatto che sia uno studio e prodotto italiano
come al solito mi piacerebbe sentire una vostra opinione dato che siete del settore
in italia lo si usa insieme alla bioarginina di solito per l'aumento del liquido seminale e le cure di solito sono di 3 mesi no stop
fatemi sapere

Reproductive Biology and Endocrinology | Full text | The role and molecular mechanism of D-aspartic acid in the release and synthesis of LH and testosterone in human and rats

come vedete lo studio è abbastanza recente

[manakei]

E' impreciso perchè parla di volontari "sani", in realtà hanno mediamente livelli al limite inferiore di testosterone e molto bassi di LH (6 è il valore minimo fisiologico).
Poi non è stato condotto in doppio cieco, ovvero i ricercatori sapevano a quali soggetti stavano somministrando il placebo e probabilmente sono stati informati visto che non è stato rilevato appunto alcun effetto placebo che invece statisticamente è rilevante!
E' gratis perchè è stato comissionato dall'azienda che produce l'integratore...

Great ma quanto ti stai documentando?!?

[greatescape]

beh lo so che quando sono condotti dalle stesse case c'e' da stare attenti
cmq sembra veritiero non so ... so che gli studi hanno un raking e devono essere controllati
cmq hai visto che questa sostanza ha vari studi alle spalle anche da altri medici

[giovannibologna]

ma dal punto di vista sportivo cosa ci si può aspettare?

[Gomez]

il placebo in alcuni casi secondo me e' sopravalutato,
invece in questi e' un portento di sicuro,hai presente dire a qualcuno che ha preso qualcosa che glia aumenta il testo?

Cominciano a sentirsi delle bestie e questo gli aumenta davvero....
Poi se ne accorgono qualche giorno dopo magari,che le ghiandole
le hanno esaurite a furia di "esaltarsi" e gli ricade giu' a picco,
pero' intanto i test sono venuti falsati....


Comunque speriamo che sia vero...

[greatescape]

io ho riportato lo studio che cmq non è inerente a pratiche sportive
se è vero che è da banco senza ricetta e se uno lo vuole provare lo puo fare un mese piu o meno costa un po' (il prezzo è pubblico)
i parametri da valutare che interessano a noi sono aumento della forza, della libido, miglior tono muscolare ecc

[Gomez]

questo comunque e' proprio uno di quei casi in cui persino io
che sono scetticco ammetto la tremenda azione di un placebo...
immaginatevi uno che e' convinto di avere livelli altissimi di testo...

[M.Ivanko]

Rispolvero questo 3d, è questo l'ingrediente contenuto nell'hard-fx di cui si parla alla sezione integratori non notificati?
Sembra interessante.

[gian90]

si è lui, ma il dosaggio sara' moooolto inferiore

[mistersalvo]

quale farmaco da banco lo contiene??

[mistersalvo]

http://www.fituncensored.com/forums/...5-dadavit.html

[Alberto86]

qualcuno ha provato il dadavit? comunque in quella discussione Guru dice che incrementa l'attività del progesterone e prolattina...sapete nulla?